基因敲除突变体制作(KO))


基因敲除技术是人为地使靶基因的序列发生碱基对的增添、缺失或替换,引起的靶基因结构的改变,以达到定点修饰改造特定基因的目的?;蚯贸际跏欠聪蛞糯а芯恐凶钪匾募际豕ぞ??;蚯贸呗碛愎惴河τ糜谝糯?、发育生物学、细胞生物学、医学、环境毒理学、水产育种学等研究领域。


斑马鱼基因敲除技术服务合同-活性sgRNA筛选

技术路线

1 分析目标基因的基因组结构

2 设计并体外合成sgRNA

3 体外合成Cas9 mRNA

4 鉴定所制备的sgRNA是否具有在斑马鱼胚胎内引导Cas9切割目标基因的活性


斑马鱼基因敲除技术服务合同-敲除突变体的建立(F1代)

技术路线

1 将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA共同注射斑马鱼受精卵

2 将经注射的受精卵饲养至30-45日龄时,通过对尾鳍的基因组鉴定确认Founder体细胞携带目标基因突变的等位基因

3 获得Founder的F1代

4 至30-45日龄时,通过剪尾鳍的方法进行基因型鉴定,筛选F1个体,获得基因敲除突变体



基因敲入突变体制作(KI)

斑马鱼基因敲入技术服务合同—活性sgRNA筛选

技术服务流程

1 分析KI位置附近的DNA序列特征

2 设计单链供体(donor)

3 设计并体外合成sgRNA

4 体外合成Cas9 mRNA

5 鉴定所制备的sgRNA是否具有在斑马鱼胚胎内引导Cas9切割目标基因的活性

6 体外合成单链供体


斑马鱼基因敲入技术服务合同—基因敲入突变体建立(F1代)

技术服务流程

1将单链供体和有活性的sgRNA以及Cas9 mRNA共同注射到斑马鱼受精卵,建立基因敲入(KI)初建者(Founder)

2 提取10枚初建者的基因组DNA,通过扩增目标序列,鉴定确认Founder体细胞携带敲入的目标基因(KI)

3 获得Founder的F1代

4 至60日龄时,通过剪尾鳍的方法进行基因型鉴定,筛选F1个体,获得基因敲入突变体



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